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用Co-IP研究蛋白質交互作用 ?小心錯過data
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用Co-IP研究蛋白質交互作用 ?小心錯過data
蛋白質體
2017-06-06

用Co-IP研究蛋白質交互作用 ?小心錯過data

自人類基因體解碼後,生命科學就轉而瘋狂投入研究蛋白質體領域,它是目前極具潛力的治療發展方向,因為不論在癌症或是神經退化性等疾病,蛋白質之間原有具專一性的交互作用(Protein-protein interaction)失衡,都是疾病進展的主因。但在研究蛋白質交互作用這塊,一直都欠缺更好的工具,現有Co-IP技術的限制不儘使研究進展緩慢,更令人驚訝的是,還會造成重要data被錯過了! 快看本文內容將你遺失的data找回來吧 !

 

充滿研究價值的蛋白質交互作用(Protein-Protein Interaction)

 自人類基因體解碼後,生命科學就轉而瘋狂投入研究蛋白質體領域,原因在於蛋白質是人體中具有生物活性功能的物質,經過多年的研究,已有超過2萬個蛋白質陸續被發現,各自擔任酵素、訊號受體、抗體或是內分泌激素等不同角色,而更關鍵的發現是,蛋白質之間是靠著具有專一性的交互作用(Protein-protein interaction),在人體中形成了一個超級複雜的交錯網絡,調控著我們的生理機制。也因此,當這樣的複雜網絡一旦失衡,就可能會造成人體疾病的發生,而將失衡轉為平衡的策略,已有許多研究指出這是一個極具潛力的治療方向,目前在癌症或是神經退化性等疾病的治療發展,都能看到蛋白質交互作用的身影。

 

Co-IP會錯過data的三個原因

蛋白質體學的研究工具非常的多,但在研究蛋白質交互作用這塊,一直都欠缺更好的工具,目前大多是使用共同免疫沉澱法(Co-Immunoprecipitation, 簡稱Co-IP),它目前被認為是可以真實呈現細胞內蛋白質交互作用的研究工具,因為它使用抗體來進行辨識對應的內源性蛋白質(endogenous protein),可不需要透過改變蛋白質結構等來進行分析 (例如將蛋白質修飾成帶有部分螢光蛋白質的FRET技術)。

而Co-IP的卻也有許多限制,主要在三個方面:

(圖一)

第一、它搭配西方墨點法的偵測靈敏度,蛋白質的濃度必須至少要在10~20 pg以上(圖一),也因此某些內源性含量偏低的蛋白質,常常必須使用基因轉染技術(gene transfection)使蛋白質過度表現,才能得以被偵測到,但也就失去了它原有的真實性了。

(圖二)

第二、使用抗體來辨識蛋白質,是Co-IP的優點也是致命缺點,因為與蛋白質結合的抗體,在西方墨點法所需的蛋白質變性過程中,重鍊(heavy chain)與輕鍊(light chain)會解離,並分別會在蛋白質電泳的48 kDa與24 kDa的位置產生背景值(圖二),會干擾該大小分子量的蛋白質data。

(圖三)

第三、裂解細胞的過程是必須的,才能取得蛋白質(圖三),因此若想研究蛋白質交互作用的位置,如是在細胞膜、細胞核內,還是在細胞質的特定胞器中,就必須要再使用其它技術進行輔助了。

 

讓你不再錯過data的解決方法

以上三個原因也正在困擾你嗎?要一次解決,並非難事!已有科學家發展出一種技術,它一樣利用抗體來作為蛋白質交互作用的辨識工具,保留專一性,但不同的是,該團隊研發出了兩種核酸序列,可以結合在抗體的重鍊(heavy chain)位置上作為旗幟,旗幟再經由環狀增幅技術(rolling circle amplification)將螢光訊號放大,進而提供比Co-IP高出100倍的靈敏度(圖四),讓研究內源性蛋白質的交互作用,再也不是夢。更創新的是,這樣的抗體應用,不需要將細胞進行裂解,只要將培養玻片上的細胞,依循操作手冊進行固定以及反應,搭配DAPI或是胞器分子標誌作辨識,即可用螢光顯微鏡觀察蛋白質交互作用位置是在細胞膜、細胞核內,還是在細胞質的特定胞器中發生(圖四);還有迷人的一點,是研究人員再也不用忍受Co-IP過程中抗體所產生的背景值,新技術可以呈現科研者過去未曾經歷的高解析data ! 這樣的創新技術,正廣泛地應用在如肺癌標靶EGFR tyrosine kinase、阿茲海默症Tau蛋白質磷酸化的新藥開發,以及癌症exosome的預後診斷應用等!還有更多的應用可能,期待你一同來發展 !

 

(圖四)


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