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最近大家都在"腸道菌",你準備好搭上這波浪潮了嗎 ?
專題報導
最近大家都在"腸道菌",你準備好搭上這波浪潮了嗎 ?
神經科學
2017-06-06

最近大家都在"腸道菌",你準備好搭上這波浪潮了嗎 ?
腸道菌是人體必要的器官

美國史丹福大學的David Relman教授2005年在「科學」期刊,發表第一篇利用基因體學概念研究腸道菌的論文。他發現人的腸道菌遠比我們想像的還要複雜,有數幾千種而且在當時多數是未知的新菌種。因此他在這篇重要論文的第一句就說:「腸道菌是人體必要的器官,它們提供養份,調控腸道細胞的發育,誘導免疫系統的發展,但是令人驚訝的是我們對它們的認識如此不足!」。腸道菌是必要器官?這聽起來有點不可思議,對吧!但隨著近幾年許多科學家的投入研究,這觀點越來越被接受。他們發現腸道裡的細菌能組成一個群體,能解讀來自身體其他器官(特別是大腦)的訊息,做出適當的反應;也能感知環境的變化,然後向其他器官發出訊息,已有研究指出腸道菌可以影響我們的代謝狀況,肥胖與它們有關係,甚至憂鬱症、自閉症等也都與它們脫不了關係 !

為了進一步確認腸道菌與腦部的溝通,他們將兩群的小鼠做了逆測試

腸道菌與帕金森氏症

腸道菌如果被當作是一個器官,那如何證實它能與腦部溝通呢?在2016年「細胞」期刊中,Dr. Mazmanian團隊使用了能產生有行動障礙類似帕金森氏患者症狀的基因轉殖鼠,來進行這樣的驗證。他們將這樣的小鼠分成兩群,一群腸道處於無菌(Germ-free)的狀態,另一群則僅是無特定病原菌(specific pathogen-free)環境下飼養,無特定病原菌(specific pathogen-free)的小鼠在某些腦部區域,可用原位免疫螢光染色法觀察到較多的α-synuclein蛋白質不正常堆積,在西方墨點法中也同樣定量出比較多的不可溶性α-synuclei蛋白質,同時他們也有發現到α-synuclein蛋白質數量沒有變多(confirmed by real-time PCR),推論腸道菌應該是透過調控機制促使α-synuclein蛋白質不正常堆積,而非使其數量增多。

為了進一步確認腸道菌與腦部的溝通,他們將兩群的小鼠做了逆測試,他們從無特定病原菌(specific pathogen-free)小鼠的糞便取出菌叢餵食給原本腸道處於無菌的小鼠(Ex-GF);而將無特定病原菌(specific pathogen-free)小鼠進行一系列的抗生素餵食(Abx),一陣子後,他們觀察到原本腸道無菌的小鼠出現了行動障礙,而且排便數量也減少;而進行抗生素餵食的小鼠,行動障礙減緩了,而且排便數量也增加了。最後他們從帕金森氏症患者的糞便取出菌叢餵食給原本腸道處於無菌的小鼠,發現也可誘發小鼠產生動作障礙。這樣的發現,指出了在帕金森氏症患者的腸道中,的確存在或缺乏一些菌種是與常人所不同的,而且它們能與腦部溝通並且與疾病機制有關。

讓抗體束手無策的神經退化性蛋白質

研究神經疾病,找到合適分析工具相對是很有挑戰性的,因為許多神經性疾病,如阿茲海默症或帕金森氏症的患者,他們腦部多可以觀察到特定蛋白質:amyloid-beta / α-synuclein蛋白質有不正常堆積的現象。蛋白質經不正常推積後它的特性會改變,舉例如α-synuclein,當它從單體(monomer)變成聚合物(oligomer)時,因著結構改變它也從可溶性變成不可溶了。因此,要定性這樣的聚合物蛋白,第一個限制就是通常需要使用可辨識”聚合物結構”的抗體;而因著結構的完整性影響了分析結果,所以蛋白質是無法接受變性處理的,也就是說聚合物蛋白質只能在固定狀態下被分析,因此第二個限制就是如果要用西方墨點法做蛋白質定量,就必須增加額外步驟處理使聚合物構性不被破壞。

定性跟定量難道不能一次搞定嗎?你可能想到可以使用可辨識”聚合物結構”的抗體,搭配免疫螢光染色來完成這個需求,但從許多抗體公司提供的α synuclein-aggregation specific antibody出廠報告,你可觀察到兩件事,第一件事,即使是同樣標榜可以定性α-synuclein aggregation,不同抗體作出的效果也並非能夠完全吻合;第二,用抗體來區分單體(monomer)還是聚合物(oligomer),非常容易產生混淆的螢光數據,這也是為什麼這篇研究,還是用了西方墨點法進一步驗證免疫螢光染色數據的主要原因。

 

抗體結合了PLA,就能比免疫螢光染色(anti-α synuclein monome)具有更好的專一性

分析堆疊蛋白質(oligomer)讓你困擾嗎?你可以這樣辦 !

2015年的「腦」期刊中,有研究團隊利用了proximity ligation assay(PLA),開發出可以同時定性以及定量α-synuclein oligomer的技術。這技術同樣使用了抗體來作為蛋白質交互作用的辨識工具,保留專一性,但不同的是,它將相同抗體分成兩群,一群接上稱為Plus的核酸序列,另一群接上稱為Minus的核酸序列;當兩群抗體同時被加入在含α-synuclein oligomer的組織中時,在辨識蛋白質聚合物時能有機會隨機靠近彼此,抗體上的Plus與Minus核酸序列,當距離夠近時(≦40 nm),在添加一個與Plus與Minus核酸序列互補的環型序列進樣品時,才能夠同時把三者接合在一起,進而才能被環狀增幅技術(rolling circle amplification)放大螢光訊號。螢光訊號因著抗體與正反股核酸序列設計,使得訊號不再只仰賴抗體,反而提高了專一性。這樣的技術,在文獻中用了α synuclein monomer / oligomer / fibril 來確認PLA的定性能力,並也使用beta-amyloid oligomer作為對照組,文獻證實一樣的抗體結合了PLA,就能比免疫螢光染色(anti-α synuclein monome)具有更好的專一性,而且更好的是,因著螢光數據的可信度增加也可以將這樣的數據以定量來呈現!

你也想嘗試新技術來解決分析oligomer或homodimer蛋白質的煩惱嗎?先別急著丟掉你手中的免疫螢光染色抗體,聯絡我們,讓我們協助你。

 

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